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最先进的prime editor 3 (PE3)系统包括编辑器、Cas9 H840A缺口酶和突变体逆转录酶（RT酶）的融合蛋白（以下简称NMRT）、prime editing guide RNA (pegRNA)和另一种单向导RNA（sgRNA）。pegRNA包含一个引物结合位点（PBS）和一个逆转录（RT）模板，用于引入新的遗传信息。

2021年6月8日，西北农林科技大学王小龙及上海科技大学黄行许共同通讯在Cell Research上在线发表了题为“Enhancing prime editing by Csy4-mediated processing of pegRNA”的文章，发现PBS一般在pegRNA的3′端有10-16 nt，与pegRNA的5′端部分间隔物互补，它们的退火预计会导致pegRNA环化，这可能会妨碍编辑。

总之，该研究在PE中引入了多种修饰以产生ePE，这明显地提高了编辑效率。然而，ePE可能会引起indels，而且在该系统中加入Csy4可能会妨碍其传递。因此，还需要进一步优化。

为了验证这一假设，研究人员通过删除PBS和RT（"截断的pegRNA"）或用与PBS相同大小的随机序列代替PBS来制作不可环化的经典pegRNA衍生物，然后比较它们与经典pegRNA一起在四个目标基因（FBN1、ALDOB、SITE1和FTL）上诱导Cas9介导的DNA indels的能力。

事实上，这两种变化可以防止pegRNA的潜在环化，经典pegRNA、截短pegRNA和RaPBS-pegRNA诱导缩减的效率为14.2%、53.2%和36.0%（在FBN1）或55.4%、75.5%和81.4%（在ALDOB）或6.0%、55.8%和42.5%（在SITE1）或14.7%、25.6%和24.2%（在FTL）。

接下来试图防止pegRNA环化，同时保持PBS和RT模板的完整性，这对pegRNA在PE系统中的功能至关重要。为此，将20nt的Csy4识别位点融合到经典pegRNA的3′端。这个位点自然存在于I-F型CRISPR-Cas系统中，形成一个发夹，当附加到pegRNA上时可能会抑制环化。在FBN1的效率从14.2%提高到23.8%，在ALDOB的效率从55.4%提高到74.9%，在SITE1的效率从6.0%提高到32.2%，在FTL的效率从14.7%提高到23.8%。

使用PE3，接下来比较了经典pegRNA（经典PE）和扩展pegRNA（扩展pegRNA PE）在产生点突变方面的性能，发现在测试的6个位点上，不同编辑类型的靶向碱基转换率明显提高。随后，将nick-sgRNA与扩展的pegRNA相融合，使它们在一个转录本中共同表达，这可能有助于优化这两种引导物的化学计量。同时，为了将nick-sgRNA从转录本中释放出来，将NMRT与Csy4-T2A相融合，Csy4 RNase可以选择性地在Csy4识别位点的3′端进行切割。用pCMV-Csy4-NMRT，表达含有扩展pegRNA和nick-sgRNA的单一转录本（该PE被命名为共表达PE）与经典PE相比，在6个测试位点的点突变平均增加0.8倍。

将pegRNA支架中连续的第四个尿嘧啶突变为胞嘧啶，消除了一个假定的转录终止信号，从而增加了pegRNA的表达和质粒编辑。因此，将扩展的pegRNA支架上的连续尿嘧啶的第四个尿嘧啶突变为胞嘧啶。由此产生的PE系统被称为增强型质粒编辑系统（ePE）。

ePE显示，在HEK293T细胞中，6个测试位点的点突变平均增加了1.0倍，在其他位点增加了2.6倍。因此，与传统的PE相比，ePE导致点突变的编辑效率平均提高了1.9倍。同样，在HeLa细胞中，EPE的活性比经典PE高3.8倍，在小鼠N2a细胞中高4.9倍。

基因组编辑的保真度对其治疗和临床应用具有重要意义。三条证据表明，ePE的保真度与典型的PE相当。首先，在所有13个测试的人类位点上，围绕目标碱基2bp的编辑副产品对于EPE来说是检测不到的，就像经典的PE一样。第二，在突变时，EPE在目标位点上诱导出的非预期的indels的频率仅略高于传统的PE。第三，在缩减过程中，EPE诱发了类似水平的非预期indels。最后，检查了Cas9缺口酶在Cas-OFFinder5预测的位点上进行的脱靶编辑，发现这两个系统是相当的。

总之，研究人员在PE中引入了多种修饰以产生ePE，这明显地提高了编辑效率。然而，ePE可能会引起indels，而且在该系统中加入Csy4可能会妨碍其传递。因此，还需要进一步优化。

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